質(zhì)粒的制備

 
電泳檢驗(yàn)測(cè)定：質(zhì)粒電泳普通有三條帶，作別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型

吸光值檢驗(yàn)測(cè)定：認(rèn)為合適而使用分光光度計(jì)檢驗(yàn)測(cè)定260nm、280nm波長(zhǎng)吸光值，若吸光值260nm/280nm的比率介于1.7－1.9之間，解釋明白質(zhì)粒品質(zhì)較好，1.8為*，低于1.8解釋明白有氨基酸污染，大于1.8解釋明白有RNA污染。

實(shí)驗(yàn)材料：包括質(zhì)粒pUC18載體的結(jié)腸桿菌菌液，克隆有稻子外源斷片的BAC的結(jié)腸桿菌菌液電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

實(shí)驗(yàn)原理：在pH 12.0 ~ 12.6堿性背景中，球菌的線性大分子量染色體DNA改變性別分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA固然改變性別但仍處于拓?fù)鋽嚁_狀況。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大多染色體DNA、大分子量的RNA和氨基酸在去污劑SDS的效用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA還是為可溶狀況。經(jīng)過(guò)離心，可去掉除掉大多細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及氨基酸，質(zhì)粒DNA尚在上清中，而后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步醇化質(zhì)粒DNA。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.取包括pUC18質(zhì)粒的結(jié)腸桿菌菌液于LA營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)上真空干燥箱37℃過(guò)夜培育；

2.汲取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，使聚在一起菌體，倒掉菌液；汲取1.5 ml菌液，再次使聚在一起菌體，盡力將菌液倒整潔；

3.參加300 ml溶液 I振動(dòng)打勻，從新懸浮細(xì)胞，震動(dòng)混電熱鼓風(fēng)干燥箱勻（注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；

4.用無(wú)菌牙簽兒挑取單菌落，接種于包括Amp抗生素的LB營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中，37℃搖床~250 r/min過(guò)夜培育；

5.參加300 ml溶液III顛倒混勻，安放于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；

6.參加300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，安放至清脆，普通不超過(guò)5分鐘；

7.12000 g離心10分鐘；

8.汲取800 ml上清液（注意：不要汲取到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，參加2/3大小的異丙醇，室溫下安放5分鐘干燥箱；

9.質(zhì)粒、BAC的品質(zhì)檢驗(yàn)測(cè)定，于-20℃保留。

10.倒盡上清，加75酒精浸洗除鹽（安放一會(huì)兒或離心3分鐘后倒去上清）；

11.12000 g 常溫離心15分鐘；

12.室溫安放或超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA；

13.加40 ml滅菌超純水或TE溶解；